直播回顾 | 单细胞测序:从样本制备到数据挖掘的全流程探讨

2023年6月7-8日，瑞沃德特邀达普生物产品经理潘鑫和达普生物、高级科学家肖之夏做客直播间，以“单细胞测序:从样本制备到数据挖掘的全流程探讨”为主题进行精彩分享，在线与大家一起探讨单细胞测序的奥秘！

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6月7日，达普生物产品经理潘鑫老师，围绕“从测序演变探讨单细胞测序样本制备与建库解决方案”主题进行分享，从测序发展概述、单细胞测序到样本制备及建库重点难点解决进行全面讲解。

其中，潘鑫老师为大家分享“达普生物Galaxy系统与瑞沃德单细胞悬液制备仪无缝连接”案例，再次强调瑞沃德与达普生物双方强强联合，携手推进单细胞测序领域发展的决心。

6月8日，达普生物、高级科学家肖之夏老师为大家分享“单细胞测序生信分析及数据挖掘”的主题内容，详解生信分析概要、生信报告解读、生信数据挖掘及案例展示以及如何搭建一个好的生信平台。

其中，肖之夏老师在线仔细解读“Scaling of scRNA-seq experiments”“scRNA-seq Workflow & Application”“Reads Quality & Mapping Statistics”等等单细胞技术的核心要点及步骤。

答疑精选，问题详解

在直播答疑互动环节，两场直播在微信视频号、哔哩哔哩等平台收到很多在线观众提问，现将两场直播聊天区的问题，精选26个来详细解答。

聊天区部分问题详解

6月7日样本制备

1. 请问老师微流控芯片最多可以同时处理多少个样本呢？

答：达普的Galaxy单细胞建库系统，每张芯片有可以同时处理4个样本的，也有可以同时处理8个样本的，且芯片上的每个样本都是独立运行，单次可处理1个样本，不影响芯片下次使用。

2. 请问单细胞测序对样本有哪些要求呀？

答：单细胞测序要求尽量采用新鲜的组织样本或血液样本进行单细胞悬液制备，单细胞悬液制备后要求细胞活性大于85%， 团块率小于5%，细胞浓度500-1200cell/μL，非细胞杂质占比小于30%。

3. 双胞率多少？如果会的话后续结果有影响吗？

答：通过人鼠混合细胞进行双包率测序，结果显示Galaxy 平台的双包率为1.1%/3000个，后期数据分析的时候可以过滤掉。

4. 利用消化酶解离细胞的时候，会不会影响细胞的表面抗原影响后续流式分选？

答：在保证细胞活性能满足建库要求的前提下，对细胞表面抗原影响较小，酶解是比较经典的组织解离方式，一般流式分选前的细胞悬液制备也都是通过这种方式实现，绝大部分样本效果还是比较好。

5. 神经元样本怎么做单细胞测序？

答：条件允许情况下，应将组织样品充分灌注后进行解离。神经元样品制备细胞核悬液操作相对简单，且杂质较少，颗粒参数更适合单细胞平台上机。如果能够制备出满足平台上机要求的单细胞悬液，也可以使用单细胞悬液上机，可尝试使用瑞沃德脑组织解离试剂盒。

具体的操作方法我们也有各地域专业的技术支持同事根据不同样本类型来提供给您一些处理意见。

6. 老师这里讲的都是肿瘤相关的，发育相关的研究单细胞测序怎么做啊？

答：根据研究需求，取不同发育阶段组织样本进行单细胞转录组测序， 之后构建细胞图谱，鉴定细胞类群，找到跟发育相关的生物标志物，通过拟时性分析细胞的发育轨迹等，分析基因网络调控等，以揭示细胞发育的深层机制等。

7. 你好，间充质干细胞进行测序的话怎么处理样本呢？

答：如果您只想做单纯的间充质干细胞测序的话，在制备组织单细胞悬液后，先需要通过流式或磁珠分选的方式富集间充质干细胞，之后再按常规样本进行单细胞测序文库构建，测序及数据分析即可。

8. 带荧光细胞分选要注意什么？

答：细胞荧光对单细胞测序的捕获和建库过程没有影响，可正常进行实验操作。

9. 外周血样本如何储存？

答：准备进行单细胞测序的外周血样本，需要先分离PBMC之后再收集PBMC加入冻存液进行梯度冻存。

10. 请问，手术组织标本，放RNA-later，冻-80，可以用来单细胞测序吗？

答：冻存和固定后的细胞不建议进行单细胞测序，加了RNA-later，组织细胞活性会受损，这个试剂主要是固定RNA，方便后面RNA提取，而单细胞测序对细胞活性有比较高的要求，一般来说如果条件允许，尽量别冻存后复苏做单细胞，之前做过老师冻存的样本，发现中位基因数会低，以及细胞类群相比于新鲜的会有所改变。

11. 请问可不可以做细胞核单细胞测序呢？

答：细胞核的样本的单细胞测序也是可以兼容的，我们之前尝试过人鼠细胞系混合样本提核，效果还不错。

12. 老师您好，不同测序平台有什么区别吗？我们该如何选择？

答：对于Galaxy 单细胞建库系统构建的文库，在不同测序平台上的主要区别是价格不一样， 所以怎样选择主要是看您对测序价格的考虑；Galaxy构建的文库在不同测序获得数据是高度一致的。

而对于一些其他平台构建的单细胞测序文库在不同平台上测序除了价格上的差异，另外就不同测序平台测出的基因中位数可能会有20%左右的差异， 这时选择就需要综合数据质量和价格双因素综合考虑了。

13. 请问老师有推荐的实验工具或者软件吗？ 

答：单细胞测序的整个流程包括包括样本解离，细胞悬液质检，文库构建与质检，测序及数据分析，在组织样本解离与悬液质检这部分，可以通过手动酶解方式，也可以通过酶解+自动解离方式，瑞沃德有配套单细胞悬液酶解试剂盒、全自动单细胞悬液制备仪、细胞计数仪供大家完成单细胞悬液及细胞质检部分的工作，在单细胞建库这部分，达普生物有Galaxy 单细胞建库系统及配套的3’转录组试剂供大家适用，并且有配套的生信分析软件StarScope帮助大家完成从原始数据到生信报告的分析，导出的表达矩阵可兼容第三方软件下游的分析软件我们推荐使用， 测序可以兼容主流的测序平台如Novaseq vs T7等。

6月8日 生信分析问题解答

1. 老师您好，有好用的工具或软件推荐吗？

答：对于生信数据部分，原始数据分析可以使用达普自主研发的StarScope软件进行分析，获得表达矩阵后，可以兼容第三方的软件，下游的分析软件我们推荐使用：

seurat（网址：https://satijalab.org/seurat/articles/install.html）

scanpy（网址：https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/）

scater（网址：https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/scater.html）

如以人PBMCs为例，细胞鉴定可以借助CellMarker2.0软件 ；数据的整合分析可借助Seurat5 工具；

2. 请问老师有哪些单细胞数据库是比较好用的呢？

答：目前比较好用的数据库有：Panglaodb，Human Protein Atlas等。

3. 如何判断数据的质量是否ok？有固定的某几个数据综合来看吗？或者数据的值高于某个固定数值，就能表明数据的质量是比较好的？

答：判断数据质量最直观首先看测序的Q30是否大于90%， 其次看捕获的细胞数，细胞捕获大于45%以上是比较正常，再就基因中位数，正常基因中位大于1000比较正常，reads Mapping到基因组上的信息是否大于90%，再深入一点就看线粒体基因污染，被检测到的线粒体基因百分数，一般细胞有>20%线粒体基因表达的话，被认为是死细胞。

Cell barcode图的拐点是否明显，不明显可能就是细胞碎片比较多。

4. 请问细胞通讯分析的计算方法中，一般是分析系统中根据不同细胞默认的一个数值？还是需要根据经验多次尝试？

答：Cell-cell communication的分析中较为常用的软件是cellphoneDB。其input包括normalized过的表达矩阵，每个细胞的细胞类型信息（需要预先进行细胞类型注释），和cellphoneDB的数据库文件。一般使用默认的参数就可以适用于大多数的研究了。

5. 分群的时候T细胞的两个cluster分的很远，没在一起怎么办？

答：如果是多样本整合的结果可以先确认下是否是批次效应等原因导致的。T 细胞本身包括两大类群CD4和CD8，在正常数据中就会存在两个不同的分群。

另外在病人或者是接受了处理的数据中，很可能还会已经有了免疫细胞的响应，在多样本整合的结果中还有可能出现多个不同响应的细胞群体，所以是有可能出现不同存在于不同的cluster的。另外UMAP和TSNE中的距离是经过特定的换算，并不能代表实际的细胞距离。

6. 老师好，单细胞过滤的时候，有关红细胞基因是否要过滤？

答：一般单细胞悬液制备的过程中，都会加一个破红的过程以去除红细胞，正常情况都不做红细胞过滤处理。

7. 老师好，想请问下，要拿到像您show的那么漂亮的数据，对细胞的要求是怎样的呀？

答：对细胞的要求是，首先无论组织样本还是血液样本，尽量采用新鲜样本， 细胞悬液活性85%以上，团块率小于5%， 细胞浓度不低于500-1200cell/μL。

8. 想问一下老师，影响测序深度的因素有哪些呀？

答：影响测序深度主要是组织类型和状态，细胞捕获数和测序的数据量，测序数据量越高，测序质量好，测序深度就越高。

9. 孔板法和微流控各自的优缺点是什么？应该怎么选择呢？

答：孔板法的有点是对细胞活性要求相对低一些，缺点是单次运行样本数量少，一般1-2个样本，且每张芯片上微孔数有限，细胞上样量相对较低，获得细胞较少；

微流控的优点是单次可同时处理多个样本，且每个样本可上数万个细胞，细胞捕获率也比较高，50%以上，需要根据实验的需求及样本情况进行选择，希望获得更多细胞样本的信息可以选择微流控平台；对于样本量少，细胞活性也不好的样本，可以试试微孔板法，应该也能获得一部分细胞的信息。   

10. 请问老师测序的数据量和捕获细胞数对数据的结果影响大吗？

答：不同的测序深度，在达到饱和之前，获得基因中位数据和细胞数量相差比较大，基因中位数不同的组织样本的标准差别较大，一般应该大于1000；捕获的细胞数量对不同研究需求有一定的影响，如一些稀有细胞群的鉴定可能会受影响。

11. 请问老师影响捕获细胞数量的因素有哪些呀？

答：影响细胞捕获的因素包括：细胞悬液的质量（活性，细胞碎片、团块率），投入的细胞数量及单细胞包裹是否成功，反转录建库试剂盒性能等都会影捕获的细胞数量。

12. 3'和5'的基因表达文库有什么不同吗？

答：3'和5'的基因表达文库的不同一个是获得3'端基因序列，一个是获得5'端基因序列，5'端主要用于免疫组库的分析

13. 请问能专门做粒细胞的单细胞测序吗？

答：由于粒细胞离体后仍然非常活跃，容易在获取过程或实验过程中破碎、死亡，有些研究表明其会向背景中释放可剪切游离核酸片段的物质，影响测序质量，以上因素导致含粒细胞比例较大的样本很难得到有效的单细胞测序数据，一些多组学实验中则需要设法去除中性粒细胞。

截至目前，针对粒细胞的高通量单细胞测序尚无高质量的数据结果。

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