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戊巴比妥钠和异氟烷对大鼠急性应激反应的影响

2015-8-24 15:14:23      点击:

研究背景:麻醉后处死动物在应激方面的研究是普遍的,但是麻醉对结果的影响研究不足。我们的目的是探究不同麻醉剂的影响,如在大鼠急性应激反应时腹腔注射戊巴比妥钠或吸入异氟烷。

方法:将大鼠随机分为电击(FS)和非应激对照组,进一步设定处死程序:直接斩首,腹腔注射戊巴比妥钠或吸入异氟烷后斩首。再设定一组对照组腹腔注射生理盐水后断头处死。测定血浆皮质酮(CORT),睾酮和雌二醇,下丘脑应激相关分子表达的促肾上腺皮质激素释放激素,血管加压素和催产素,与额叶相关分子表达的NMDA受体NR2B亚单位,GABAA受体和神经元烟碱型乙酰胆碱受体

结果:直接斩首组和异氟烷电击(FS显著增加血浆皮质酮(CORT),而腹腔注射戊巴比妥钠注射后,这种应激反应未出现。非应激对照组动物,无论是注射生理盐水还是戊巴比妥钠都引起的血浆皮质酮(CORT)显著增加。各组间性激素水平和大脑中的相关分子mRNA的表达差异显著。

结论:混合注射麻醉导致动物应激反应,妨碍了血浆皮质酮(CORT)水平,但影响血浆性激素水平和大脑mRNA的表达。异氟烷吸入应激反应影响较少,而且从实验动物伦理的角度来看,也是最理想的。

1.        简介

应激反应与情感性精神障碍病因学的关系[ 1 ]促进了动物模型应激反应的研究。压力调节系统如下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴活动已在不同的应激活动下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)活性研究是由促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)驱动的物质主要来自下丘脑室旁核(PVN)的下丘脑。HPA轴的最终目标的压力荷尔蒙激素,这主要是在大鼠皮质酮(CORT)。我们和其他组发现性激素如睾酮(T)、雌二醇(E2)和神经肽,如精氨酸加压素(AVP)和催产素(OXT),在压力反应[ 2 ]起重要调节作用。

  处死动物的方式来研究可能的混淆作用引起了我们的关注。相关的生物学研究处死动物一般有两种方法:直接断头或给药后麻醉断头。断头可能是一个潜在的额外的压力,这也取决于研究者的经验,会影响研究结果[ 3 ]。无意识的麻醉药似乎减少了额外的压力[ 4 ]。然而,一些药物,如苯巴比妥,也会引起额外的应激反应,表现为增加血浆CORT水平[5,6]。此外,麻醉剂影响兴奋性受体抑制大脑的活动,包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体NR2B亚单位与神经元烟碱型乙酰胆碱受体(nnachr),通过抑制受体刺激如GABAA受体(GABAAR)[ 7 ]。到目前为止是否经常使用麻醉剂如腹腔注射(ip)戊巴比妥钠或异氟烷吸入可能影响大鼠脑mRNA表达与在急性应激反应有关的分子,也不清楚腹腔注射戊巴比妥钠如何引起动物的附加应激。

  因此我们分析了经验丰富的研究员用不同方式处死动物的影响,大鼠腹腔注射戊巴比妥钠和吸入异氟烷后电击(FS)和不刺激对照组比较,比较内容包括血浆CORT,T和E2水平,下丘脑CRH mRNA水平,AVP和OXT,与额叶NMDA-NR2B、 GABAAR、 mRNA和nnAChR的表达水平。

2.        实验方法

2.1     伦理陈述

所有动物使用和实验均按照实验动物的使用和保护指南(National Research Council, 1996, USA),经中国国家委员会浙江分会批准。尽最大努力来减少动物的痛苦,并尽可能少用动物(更多细节见补充材料1)。

2.2     电击大鼠

雄性SD大鼠(体重300-330g),饲养在25-27℃房间,12h明暗交替,自由摄食饮水。给予一周时间适应环境。拟定0.5mA电刺激5s,然后间隔25min。动物居住条件和卫生细节连同FS协议见辅助材料1.将大鼠随机分为7组:1)对照或2FS通过直接断头处死大鼠(分别为黄连解毒汤,FSD);3)控制或4)腹腔注射3.5%戊巴比妥钠(3ml/kg5分钟后FS大鼠断头处死(分别为和FSP);5)对照或64%异氟醚在吸氧后1–2分钟FS大鼠断头处死(综合技术研究所或FSI组);7)额外的对照组腹腔注射生理盐水(3毫升/公斤)5分钟后断头处死(CTR)。每组7只或8只大鼠。由相同的研究人员,电击(FS)30分钟内处死动物,实验在每日15:00-16:00之间。采血、离心、收集血浆。迅速取出大鼠大脑、下丘脑和额叶进行解剖。根据Paxinos和Watson的图集[ 10 ]下丘脑解剖位置是前囟点1.7mm。

所有的样品都是立即冻结并存储在−80°C直到进行检测。所有程序均符合当地动物保护委员会的有关规定和法律。

2.3血浆激素水平测定

采用酶联免疫法测定血浆CORT水平(RE52211, IBL Corporation, Germany)。变异(CV)的内和间变异系数分别为3.38%和10.50%。用放射免疫分析法检测血浆T水平(IM1087, Immunotech Corporation, USA),一个内和批间CV分别为2.6%和11.9%。通过酶联免疫试剂盒测定血浆E2水平(ADI-900-174, Enzolifesciences Corporation, USA),一个内和跨3.9%11.37%CV,分别。

2.4定量逆转录聚合酶链反应(PCR)在下丘脑和额叶的mRNA表达分析

对下丘脑CRH,AVP mRNA与额叶NR2B,GABAAR和nnachr表达水平的检测方法是光电导继电器Q-PCR。总之,全部 RNA用Trizol提取剂和基因与PrimeScript RT试剂盒合成。Q-PCR采用Bio-Rad cfx96触摸荧光PCR仪进行比[ 11 ]。所有的程序都是按照制造商的指示进行的。引物对CRH,AVP,OXT,NR2B,GABAAR-受体,nnachr和β肌动蛋白mRNA设计与程序Primer Premier 5。作为管家基因(见辅助材料2)

2.5统计

当数据被发现是不是正态分布,采用非参数测试。多组比较,第一–沃利斯试验采用Kruskal,如果有显著性差异,组间比较进一步进行–Mann Whitney U检验。P<0.05被认为是重要的。

3.        结果

3.1     血浆激素水平

  FSD组血浆激素明显升高(P<0.001),但是和CTRD组相比T检验(P=0.834)或E2 levels(P=0.248)无显著差异。     

类似结果被观察到,当FSI组和CTRI组相比较,血浆CORT水平显著升高(P<0.001)。血浆T(P=1.000)和E2 Levels(P=0.563)没有出现明显的变化。相比之下,FSP集团并未显示血浆CORT显著变化(P = 0.132),T(P = 0.848),或E2水平(P = 0.949)与CTRP组比较(图1)。此外,两CTRP(P = 0.008)和点击率(P = 0.004)组明显高于血浆CORT水平比CTRD组,而综合技术研究血浆CORT水平(P = 0.248)与CTRD组比较未显示出有显著差异(图1)。

3.2 下丘脑和额叶相关分子表达

在电击FS刺激处死大鼠实验无任何组在下丘脑CRH,AVP mRNA表达和催产素或额叶NR2B,GABAAR,和nnachr有显著性差异(图2)。

图2

4.讨论

目前研究表明,断头前腹腔注射戊巴比妥显著增加基础血浆CORT水平,这可能会影响研究结果。另一方面,断头前异氟烷吸入麻醉不影响基础血浆CORT水平。事实上,生理盐水腹腔注射对照组增加基础血浆CORT水平,表明是腹腔注射而不是戊巴比妥造成额外的刺激。我们还发现,麻药的使用,即腹腔注射戊巴比妥和吸入异氟烷,电击FS 30min后不干扰测量脑应激相关mRNA分子表达。

 我们发现,FS后直接断头处死大鼠或吸入异氟烷后断头处死大鼠显著增加血浆CORT水平,这与之前的研究是一致的[ 12 ]。然而,由于在非FS组皮质醇水平升高,这种应激反应在腹腔注射戊巴比妥钠注射液组没有出现。由于腹腔注射戊巴比妥钠和腹腔注射生理盐水造成的对照组血浆CORT相似的增长,而额外增加血浆CORT水平在异氟烷组或直接断头对照组未出现,额外的应激明确是来自注射本身,而不是对戊巴比妥钠化合物的效果,混淆了结果。应该指出的是,FS电击雄性SD大鼠20min后我们没有观察到血浆中T、E2水平或下丘脑CRH,AVP和oxtmrna水平或在额叶皮层NR2B, nnachr GABAA受体mRNA的表达显著差异。在某些区域的某些相关分子的表达可能没有回应,直到30分钟或更多的雄性SD大鼠的应激后。在下丘脑PVN CRH mRNA开始明显增加,2 h和1 h的AVP mRNA开始增加约束应力[ 13 ]出现,虽然2小时固定[ 14 ]后OXT mRNA没有显示变化,可4小时腹腔注射高渗盐水后显著增加[ 15 ]。这些数据可以解释在我们的研究中观察到的与应激有关的分子改变mRNA的表达。应当指出,然而,那其他一些分子mRNA的表达,如黑皮质素受体亚型4(MC4R)和阿黑皮素原,表明雄性SD大鼠下丘脑显著增加,在30分钟内从一个类似的FS电击刺激开始,在杏仁核的[ 16 ] CRH mRNA和MC4R基因mRNA表达明显增加,说明FS引发变化的分子和脑区时相关的。

我们数据表明,电击30min后,断头前麻醉大鼠不影响下丘脑和额叶相关分子血浆激素水平或mRNA的表达,但实施方式可能影响血浆CORT水平,异氟烷吸入后断头似乎维持应激反应的完整,而且从伦理学角度也是应激反应研究的最佳选择。

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